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乳酸菌（lactic acid bacteria）：一类通过发酵糖类产生乳酸的细菌，因其能够将碳水化合物发酵成乳酸而得名。常见的乳酸菌属有乳杆菌属、乳球菌属、双歧杆菌属、链球菌属等。
（图片源自网络）
乳酸菌：
身份多变的“全能大师”
🌟食品界的“明星”：酸奶、乳酪、泡菜、酸菜，这些美味的食品都有乳酸菌的身影，它们用发酵的魔法提升了食品的味道和营养价值。乳酸菌不仅让食物更美味，还常用于乳制品的质量认证和新产品的开发。
🚚生物医药界的“配送员”：乳酸菌作为药物传递载体，既安全又高效，适用于口服、鼻饲和阴道给药等方式，广泛应用于治疗黏膜感染、炎症性肠病、肿瘤及疫苗研发等领域。它们不仅能为我们传递治疗药物，还能生产胰岛素、疫苗等生物药物。
🔍健康领域的“侦探长”：乳酸菌在肠道健康方面的表现可谓“功勋卓著”。通过检测肠道菌株的丰度和分布，可以评估乳酸菌摄入对肠道微生物群落的影响。将肠道微生物组学与蛋白组学相结合，可以更深入地探索它与各种疾病之间的关联。
🥽畜牧农业中的“卫士”：乳酸菌发酵可用于制作畜牧养殖的优秀饲料，也可通过检测乳酸菌种类来优化肥料配方。此外，通过检测土壤中乳酸菌的存活率和定植能力还可以用于评估生物肥料对农作物的有效性。
🧹环境领域的“清洁工”：乳酸菌在污水处理、生态修复方面也有着出色的表现，它们通过调节水体和土壤中的生态环境，帮助修复被污染的生态系统。也可通过水体或土壤中乳酸菌种类及其浓度来评估环境生态的变化。
🫧化妆品界的“研发师”：乳酸菌发酵物在化妆品中有保湿、抗炎、修复等多种功能，通过监测其活性可评估化妆品功效并优化配方。
流式细胞仪：
乳酸菌研究中的“超能利器”
通过特定的荧光染料对乳酸菌进行染色，使用流式细胞仪能够区分活菌与死菌，并进行计数。这种方法快速、准确，避免了传统平板计数法可能存在的低估细菌数量、无法检测不形成菌落的细菌等问题。
乳酸菌饮料及发酵食物的质量控制：
通过检测产品中乳酸菌的数量，可以评估产品的品质，判断保质期，确认是否有杂菌污染。
乳酸菌自溶检测：
乳酸菌自溶会释放出胞内物质，这可能会影响发酵产品的品质，如产生异味、改变质地等。流式细胞仪可以通过检测细胞完整性等指标来判断乳酸菌是否发生自溶，为控制发酵过程和产品质量提供依据。
乳酸菌的筛选与鉴定：
结合不同的荧光标记技术和检测参数，可以对乳酸菌进行更准确的鉴定，区分不同种类或菌株的乳酸菌，这对于研究乳酸菌的多样性和功能特性具有重要意义。
研究乳酸菌与其他微生物的相互作用：
对乳酸菌和其他微生物进行标记和检测，从而研究它们之间的相互作用关系。例如，在混合发酵体系中，乳酸菌与酵母菌可能存在共生或竞争关系，流式细胞仪能够通过分析它们的数量、活力以及相互之间的接触情况等，深入探究这种相互作用的机制。
流式细胞仪用于乳酸菌死活计数是其目前最为广泛的用途之一，有关这部分的详细情报，让我们一起来看看吧。
传统上，平板培养法计数一直是乳酸菌死活计数的经典且广泛应用的方法。然而，近年来，流式细胞仪正逐步取代平板培养法成为新的首选方法，这得益于其多方面的优势：
· 高灵敏度：确保了计数的精准性
· 高效省时：短耗时提升了实验效率
· 稳定可靠：结果的高度稳定性与良好的重复性保障了数据的可靠性
· 多维分析：可有效区分活性细胞与总细胞，进一步丰富了分析维度
· 高通量：高通量分析能力极大地促进了大规模样本的快速处理
图1：流式细胞仪和平板培养法在乳酸菌死活计数工作中整体对比
图2：流式细胞仪和平板培养法在乳酸菌死活计数工作流程的对比
图3(左)：流式细胞仪和平板计数准确性比较
图4(右)：流式细胞仪和平板计数相关性
图3和图4引自《流式细胞术检测水中细菌总数的方法研究》,DOI：10.19965/j.cnki.iwt.2021-0892。
方法1：CFPA+PI染色法
💠实验原理：CFDA是一种非荧光性的化合物，具有细胞膜通透性。进入细胞后，它被细胞内的酯酶水解成具绿色荧光性的产物。这种荧光性产物生成仅限于代谢活性正常的细胞，且因不易穿透活细胞膜被限制在细胞内，结合使用PI（不能穿透活细胞膜但可以穿透死细胞膜），利用两者对细胞膜完整性差异所导致的通透性不同，我们可以使用流式的FITC通道有效地鉴别活细胞与死细胞。
💠实验流程：
图5：cFDA PI染色法操作流程图
💠实验结果：
图6：流式细胞分析图谱中活性和非活性细菌区分
双歧杆菌菌液培养物暴露于0%、0.05%、0.1%、0.2%或0.25%胆汁盐，同时用cFDA和PI染色。细胞分为4群：cFDA+PI-为活细菌，cFDA+PI+为受损的细菌，cFDA-PI+为死细菌，cFDA-PI-为杂质或碎片。
方法2：SYTO+PI染色法
💠实验原理：SYTO是一种核酸染料，具有胞膜通透性，可以穿过活细胞和死细胞膜，并与细胞内DNA结合，发出绿色荧光，可用用FITC通道检测。而PI只能通过受损或死细胞的膜。当胞膜受损时候，SYTO和PI同时进入细胞膜内，并展开对DNA的竞争性地结合，这一过程会削弱原本由SYTO产生的绿色荧光信号强度。因此，具有完整细胞膜的活细胞呈现绿色，而细胞膜受损的细胞则呈现红色。通过观察荧光信号的颜色变化，我们可以对细胞的活性状态做出判断。
💠实验流程：
图7：SYTO PI染色法操作流程图
💠实验结果：
A:
B:
图8：利用Syto9和PI染料检测细菌死活
（使用仪器——层浪Fongcyte流式细胞仪）
A：排除背景噪音/杂质，圈出 FSC和SSC较大的群落，为细菌主群；B：SYTO和PI双染，绿色荧光区域为细胞膜结构完整的颗粒即活菌，而红色荧光区域为细胞膜结构受损的细菌即死菌，右上角的细菌为过渡状态的细菌（健康活细菌到死细菌的过渡阶段）。
活菌荧光单位计算公式：
AFU=N1×a×1000(AFU/mL(g))
AFU：活性荧光单位
N1：仪器统计活菌浓度(cells/ul)
a：样品稀释倍数
1000：是ul和ml间单位换算系数
报告结果说明：采用流式细胞术对死活菌进行计数，其结果以AFU/mL(g)为单位进行报告。流式方法得到结果与经典平板培养法测得的菌落形成单位CFU/mL(g)结果之间具有显著的相关性。
👁️🗨️ 细菌直径比较小，建议FS和SS选择对数放大模式。为减少杂信号的影响，可以通过FSC-A和FSC-H排除粘连体。
👁️🗨️ 流式细胞仪检测乳酸菌的浓度时，需要将样本浓度控制在1x106-107个/ml左右，确保流式检测结果准确。
👁️🗨️ 如遇细菌与背景噪音较难区分情况，可先通过核酸染料如SYTO圈出阳性群体并设门。通过反射门方式在FSC和SSC图中圈出主细菌群体。
👁️🗨️ 由于PI的发射光谱较宽，最佳发射光617nm。流式检测时，可选择PE、ECD(620/30)或PerCP通道。建议首先ECD(620/30)或Percp通道，即可保障最佳的接收光，也可减少FITC通道信号溢漏，减少补偿调节。
👁️🗨️ 除了乳酸菌之外，流式细胞仪还可以被应用于分析其他多种菌种的相关指标，包括大肠杆菌、趋磁细菌、化脓性链球菌、球芽孢杆菌以及草生欧文氏菌等。利用流式细胞仪，可分析细菌浓度、评估细菌活力、鉴别种属，并进一步探究细菌群体分化情况等。
