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应用精要|OMIP-079:小鼠脾脏中CD4T和CD8T的幼稚/记忆亚型和Treg亚群的周期检测

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方案背景:

细胞增殖与T细胞

    细胞增殖的周期性是生物的一个基础特征。同样适应性免疫的抗原特异性T和B细胞通过克隆扩增产生大量短寿命的效应细胞和一些长寿命的记忆细胞。T细胞主要有两个亚群:辅助性CD4T细胞和细胞毒性CD8T细胞;随着时间推移,记忆性CD4+T和CD8+T通过细胞死亡、存活和低水平的稳态增殖来维持动态的平衡。在稳态条件下,未处理小鼠的脾脏中大多数T细胞是静止细胞,有少部分细胞发生分裂,这可能和未知的环境抗原和/或细胞因子驱动的稳态增殖有关。此外一些Treg细胞(CD4T细胞下的一个子集,表达核转录因子Foxp3)具有激活/增殖表型,这反应了成年小鼠的持续自我更新。

T细胞亚群

在C57BL/6小鼠中,记忆性T细胞高表达CD44,可与中/低表达CD44的幼稚(naïve)T细胞区分。同样的,在人类中可通过CD45RA的高表达或低表达将幼稚和记忆表型T细胞区分开。增殖潜能联合淋巴结归巢能力和效应功能可进一步区分记忆T细胞下不同亚型。中央记忆T细胞(CMT)也有幼稚T细胞表达的淋巴结归巢受体CD62L,而效应记忆T细胞(EMT)缺乏CD62L。人外周血T细胞最初使用CCR7,一种CCL19/CCL21的趋化因子受体作为标记物区分TCM和TEM。T细胞的另一个亚型,TEMRA细胞是重新获得幼稚表型的效应记忆细胞,在人类中为CD45RA+,小鼠中为CD44int/low。根据上述内容,小鼠CD4T和CD8T中的四个幼稚/记忆T细胞亚型可被定义为:

Naïve T:CD44int/lowCD62L+

CMT:CD44highCD62L+

EMT:CD44highCD62L-

TEMRA:CD44int/lowCD62L-

T细胞增殖与Ki67

    准确测量体内T细胞的增殖程度对于跟踪T细胞的动态反应至关重要。小鼠T细胞增殖可通过Ki67标记追踪。Ki67是一种支持染色体结构的核内蛋白,其表达量与细胞增殖的活跃相关,且在细胞周期的G1、S、G2、M期有表达,而在静止期(G0)几乎不表达。核酸染料通过DNA的含量分析细胞周期的各个阶段,如G0/G1期DNA含量为2N,S期为2N-4N,G2/M为4N。本文结合Ki67与DNA含量分析更细致划分细胞周期不同阶段,特别可区分2N DNA含量的中G0和G1期。2N DNA含量的Ki67+细胞可能是非积极增殖的G1期或由G1正返回G0期。

方案说明:本OMPI采用Ki67/DNA双重染色技术,对小鼠脾脏CD4+和CD8+幼稚/记忆T细胞亚群及Treg细胞进行离体细胞周期分析,区分G0、G1和S-G2/M期细胞。该方案适用于深入探索脾脏T细胞周期变化,尤其在T细胞亚群比例、数量和增殖状态变动的情境下,如老年小鼠记忆T细胞比例增高伴或不伴寡克隆扩增、淋巴细胞减少症小鼠的代偿性T细胞增殖、转基因小鼠Treg表达异常等。


方案详情:

1️⃣
样本类型:小鼠脾脏
2️⃣

试剂方案

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3️⃣

圈门策略

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4️⃣

实验结果

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    使用手动门控策略分析3个月大的C57BL/6J小鼠的脾脏细胞并通过5个步骤圈出活的脾脏单细胞:

A1. 通过Hoechst-33342-A vs Hoechst-33342-W圈出单DNA细胞;

A2. 通过Hoechst-33342-A在时间轴上的信号,圈出稳定采集的事件,排除在压力波动情况下收集的事件;

A3. 使用FSC-A vs eFluor780圈出活细胞;

A4. 通过FSC-A vs SSC-A圈出“relaxed”门控,该门控包括高度激活和增殖的淋巴细胞;

A5. 通过Hoechst-33342-A vs Ki67 AF700-A双参数图排除在>2n DNA群体中的Ki67int细胞,其他细胞为单细胞并用门控圈出作为后续分 析的基础。

B. 通过CD3-A vs Ki67-A双参数圈出CD3+群体,该群体为CD3T细胞;在CD3T群体下通过CD4和CD8分别圈出CD4+群体(CD4T)和CD8+群体(CD8T);在CD4T门控下通过Foxp3的表达识别出Treg群体(Foxp3+)和常规CD4T群体(Foxp3-);随后在常规CD4T群体内通过CD44和CD62L的表达定义幼稚/记忆亚群:CD44int/lowCD62L+(naïve)、CD44highCD62L+(CM)、CD44highCD62L-(EM)和CD44int/lowCD62L-(EMRA);在CD8T内进行同样的圈门策略分析幼稚/记忆群体;

C. 在Hoechst-33342-A vs Ki67-A散点图上分别分析Treg细胞和幼稚/记忆CD4T和CD8T的细胞周期:G0细胞为DNA 2n/Ki-(左下象限);G1细胞为DNA 2n/Ki+(左上象限);S-G2/M细胞为DNA>2n/Ki67+(右上象限)。

⭐该OMIP利用Ki67/DNA双染检测幼稚/记忆CD4T和CD8T细胞及Treg细胞的细胞周期,与其他OMIP无相似之处。 此方案有助于揭示不同条件下(如疫苗接种、感染、自身免疫病和癌症等)被忽视的Treg及幼稚/记忆T细胞亚群的增殖和周期变化。


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