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本研究由俄罗斯科学院谢苗亚金-奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所、莫斯科国立罗蒙诺索夫大学化学系及生物工程与生物信息学院、洛普金联邦物理化学医学研究与临床中心等多家机构合作完成。
癌症是全球范围内威胁人类健康的主要疾病之一，化疗作为重要治疗手段，其疗效依赖于新型抗肿瘤药物的开发。咔唑及其衍生物因其多样的抗肿瘤机制（如抑制微管蛋白聚合、DNA结合酶及稳定G-四链体结构）备受关注。本研究聚焦于苯并[4,5]咪唑并[1,2-c]嘧啶酮骨架的衍生物，通过结构修饰探索其抗肿瘤潜力。
新型衍生物的设计与合成
合成了一系列苯并[4,5]咪唑并[1,2-c]嘧啶酮（三环）和萘并[2',1':4,5]咪唑并[1,2-c]嘧啶酮（四环）衍生物，并引入带正电荷的侧链（如氨基、二甲基氨基和胍基），以增强其与DNA的相互作用（图1 )。
图1
新抗肿瘤活性评估
通过MTT实验评估化合物对多种癌细胞（MCF7'、A549）和非癌细胞（VA13、HEK293T）的细胞毒性，发现四环衍生物5b（含两个氨基侧链）对A549肺癌细胞具有显著抑制活性，且对非癌细胞的选择性指数（SI）高达17.3，优于传统化疗药物（如顺铂、阿霉素）（图2）。
图2
作用机制研究与结论
细胞凋亡/坏死检测
将细胞系以每孔 3×105 个细胞的密度接种于 6 孔板中，每孔加入 2 毫升 DMEM-F12 培养基，在 5% CO2 培养箱中培养 20 小时，未经处理。之后，加入 1 - 33 微升测试化合物的 DMSO 溶液（孔内 DMSO 浓度不超过 1.5%），继续培养 24 小时。收集细胞（以 200 - 300 g 离心），用 PBS 冲洗，然后重悬于 1×Annexin V 结合缓冲液中，该缓冲液由 0.01 M HEPES（pH 7.4）、0.14 M NaCl 和 2.5 mM CaCl2 溶液组成。接着，每 100 微升细胞悬液加入 5 微升 Annexin V-FITC，在室温下孵育 15 分钟。随后，再次离心收集细胞，用含碘化丙啶（每 100 微升缓冲液加入 2.5 微升 PI（1 毫克/毫升）的 1×Annexin V 结合缓冲液替换溶液，在室温下孵育 15 分钟。最后，将细胞在染色 2 小时后用 LongCyte® 流式细胞仪（层浪生物）进行分析。
用5b处理即使在高浓度下也不会导致细胞完全死亡（图3），诱导细胞凋亡也不是该化合物的主要作用机制（图4）。
图3
图4
细胞周期检测
将细胞系以每孔 1×105 个细胞的密度接种于 1 毫升 DMEM-F12 培养基中，置于 12 孔板内，在 5%二氧化碳培养箱中培养 20 小时，未经任何处理。随后，向细胞中加入 2 微升受试物质的培养基 - 二甲基亚砜（DMSO）溶液（培养基中最终 DMSO 浓度为 0.5% 或更低），继续培养 24 小时。收集细胞（以 200 - 300 g 离心），用 PBS 冲洗，然后在室温下用染色液（500 微升，RPMI1640 培养基，含 10 微克/毫升 Hoechst-33342和 0.1% TritonX100 以及 10 毫摩尔 pH 7.3 的 HEPES-KOH）染色 15 分钟。染色 0.5 小时后，使用 LongCyte®（层浪生物）流式细胞仪进行细胞分析。
发现5b在A549细胞中引起G2阻滞（图5,6）。尽管不如用公认的具有抑制G2活性的细胞抑制剂紫杉醇治疗细胞后的效果明显，但这种效果仍是显著的。
图5
图6
结论
流式细胞术分析表明，5b通过诱导G2/M期阻滞（而非凋亡）抑制癌细胞增殖。
5b作为萘并咪唑并嘧啶酮衍生物的代表，展现出高选择性和低毒性，为克服传统化疗药物的毒副作用提供了新思路。不同于典型DNA损伤剂（如阿霉素），5b通过G2/M期阻滞发挥作用，为靶向细胞周期调控的抗癌策略提供实验依据。
通过结构优化（如扩展芳香环、引入带电荷侧链），验证了DNA嵌入与G4稳定化的协同作用，为多机制抗癌药物设计提供参考。初步体内实验证实5b的安全性，为其后续临床前研究奠定基础，有望开发为选择性抗癌药物。
以上流式实验结果均由层浪生物LongCyte®流式细胞仪分析得出：
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参考文献：
Polina Kamzeeva , Nikolai Dagaev, et al. Synthesis and Biological Evaluation of Benzo [4,5]- and Naphtho[20 ,10 :4,5]imidazo[1,2-c]pyrimidinone Derivatives.Biomolecules 2023, 13, 1669.
