绝对计数在流式检测中是我们检测的重要指标之一，定义是单位体积样本（如血液样本）中，含有某种类别细胞的数目。常用的绝对计数的方法有：双平台法和单平台法，单平台法绝对计数主要分为微球法和直接体积法。双平台法操作繁琐和误差大等原因，应用较少，目前市场上绝对计数以单平台法为主。应用领域：淋巴亚群、HIV免疫检测、菌群、藻类等项目的绝对计数。

微球法是流式细胞术中最早用来开展单平台绝对计数的方法，目前被广泛使用和认可。用绝对计数微球来计算混合复杂的细胞群体中（如血样）目的细胞群的绝对细胞数量的。绝对计数微球是4 - 10 μm的荧光微球，可以被市面上几乎所有的流式常用的激发光激发（具体根据厂家说明书）。层浪开发的ModelFlower流式软件，内置微球法绝对计数算法，无需人工计算可直接得出圈内目的细胞群的绝对计数值。计算公式为：

样本准备流程：

1. 反吸法取50 μl抗凝全血加入TruCount Tubes内;

2. 加入抗体染色，CD45 - PerCp，CD3 - Violet610，CD4 - FITC，根据说明书每个抗体加入5 μl，室温避光孵育20 min（抗体用量和孵育时间根据说明书建议）;

3. 直接入加入435 μl红细胞裂红液（总体系500 μl），因抗体量不同有所差异），室温避光孵育15 min（不同厂家可调整孵育时间）；

4. 直接上机检测；

5. 设置条件，圈Beads门，微球总数，以及样本体积，软件可以自动计算圈出的淋巴亚群的绝对计数值，无需人工计算（单位：个 / μl）。

图1. 微球法绝对计数条件设置

检测和数据分析结果：

图2. 微球法绝对计数结果

图示：图A为CD45和SSC圈出淋巴细胞群，右上角为绝对计数微球的信号；绝对计数微球的圈门通常用FITC和PE双参数，如图B所示；从图A中的Lym群，圈CD3的信号，如图C所示；然后再从CD3门中圈出CD3+CD4+的信号，如图D所示；图E展示各个细胞群的颗粒数、百分比（%Parent）和微球法绝对计数（绝对计数-B）的结果。

体积法绝对计数计算公式为：细胞绝对数量（个/μl）=N（圈内总的细胞数）/V(上样体积）。市面上体积法绝对计数的流式细胞仪有蠕动泵和注射泵两种，其中蠕动泵容易发生形变，可能影响计数的结果，要求时常更换蠕动泵；而注射泵相比蠕动泵，不用考虑形变问题，而且注射泵匀速推动样本上样，上样更稳定，以及对体积的计算更加准确。

样本准备流程：

1. 反向吸样取50 μl抗凝全血加入流式管内;

2. 加入抗体染色，CD45 - PerCp，CD3 - Violet610，CD4 - FITC，根据说明书每个抗体加入5 μl，室温避光孵育20 min（抗体用量和孵育时间根据说明书建议）;

3. 直接加入435 μl红细胞裂红液（总体系500 μl），因抗体量不同有所差异），室温避光孵育15 min（不同厂家可调整孵育时间）；

4. 直接上机检测；

5. 设置绝对计数条件，设置检测样本稀释倍数（10倍），统计区可直接获得体积法绝对计数的结果。

图3. 体积法绝对计数条件设置

检测和数据分析结果：

图4. 体积法绝对计数结果

图示：图A为CD45和SSC圈出淋巴细胞群；从图A中的Lym群，圈CD3的信号，如图B所示；然后再从CD3门中圈出CD3+CD4+的信号，如图C所示；图D展示各个细胞群的颗粒数、百分比（%Parent）和体积法绝对计数（绝对计数-V）的结果。

微球法和体积法一致性分析，同时使用体积法和微球法两种方法对淋巴细胞绝对计数的一致性进行分析（n = 10），如图5所示。两种方法检测的相关系数R²为0.9928，接近1，表明两种绝对计数检验方法一致性较好。

图5. 体积法和微球法一致性检测

总结：

层浪流式细胞仪既可以微球法（免计算），又兼容体积法绝对计数。对比微球法和体积法绝对计数结果，Lym、CD3、CD3+CD4+的绝对计数结果基本一致，层浪流式细胞仪支持微球法和体积法对粒子进行绝对计数。层浪体积法绝对计数的优势：结果精确，依赖于精准的柱塞泵吸样模式；节约成本，无需额外购买绝对计数微球；耗材损耗小，无需频繁更换蠕动泵管；针对小颗粒菌群、藻类的检测，有更可靠的准确性。

关于层浪生物

层浪聚焦流式细胞领域，致力于实现流式技术系统化、自动化、智能化，在临床领域推动流式技术的常规化，在科研领域推进国产流式高端化。目前已推出多款流式产品：2激光8色流式细胞仪于2021年初成功获得NMPA注册证；高端产品科研型3激光14色流式细胞仪FongCyte™上市一年，仪器性能获得客户的高度认可；高端产品临床型3激光14色流式细胞仪LongCyte™26种型号均获CE认证。公司核心团队均在流式技术领域有10余年经验，十年如一日专注流式技术研究，致力于研发生产稳定、可靠、性能优异的产品。层浪未来将陆续推出更多高端流式产品，为中国的流式技术发展尽绵薄之力，做行业中流式技术普及者，做客户信赖的流式伙伴，为中国的临床和科研事业助飞。