细胞凋亡是指机体为维持机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的、有序的死亡。细胞坏死与细胞凋亡不同，细胞坏死是指细胞的被动死亡，通常是细胞受到物理、化学等环境因素的影响，如机械损伤、毒物、微生物等影响，引起的细胞的病理性死亡。

Annexin V是最经典的检测细胞凋亡的方法，检测原理如下图所示。细胞凋亡时形态学特征会发生一系列的变化，其中磷脂酰丝氨酸（PS）的变化是凋亡最显著的的特征之一。在正常细胞中，PS一般分布在细胞膜的内侧，在细胞凋亡的过程中，PS残余物会由脂膜内侧翻转至细胞膜表面。Annexin V可以特异性的与细胞表面的PS发生结合，但早期、晚期和坏死的细胞均有PS外翻的现象，因此在凋亡的检测过程中常搭配PI或7-AAD（核酸染料）来区别细胞早期凋亡和坏死的细胞，PI或7-AAD不能进去正常和早期凋亡的细胞与核酸结合，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对PI和7-AAD的通透性增加，在细胞晚凋或坏死阶段可进入细胞与DNA结合，标记上红色荧光。

图1.凋亡检测原理图

图2. LongCyte 3光14色凋亡数据

1. 收集单细胞悬液：不同细胞类型具体制备单细胞悬液的方法不同，悬浮细胞直接进入第2步。贴壁和半贴壁细胞用不含EDTA的胰酶进行消化，然后1500-2000 rpm离心5 min，弃上清；

2. 清洗：将离心收集的细胞用预冷的PBS洗1-2次，1500-2000 rpm离心5 min，弃上清，充分去除残留的FBS和胰酶；

3. 调整细胞浓度：加入 1× Binding Buffer，调整细胞浓度一般为0.2- 1×107/mL；

4. 染色：取100-200 ul悬液于流式管中，加入适量标记了荧光染料的 Annexin V和适量PI/7-AAD，轻轻混匀；室温避光孵育 15-20 min；

5. 上机：再加入300 μl PBS 重悬细胞上机（建议1 小时内完成检测）。

Annexin V与PS的结合依赖于钙离子的存在，因此在消化贴壁细胞时，要使用不含EDTA的胰酶，并且在标记时确保使用含钙离子的缓冲液。

Annexin V与PS的结合是可逆的，而且不容易被固定，需要在标记结束后1-3小时内必须进行上机检测；另外，PI是核酸类染料，也需要尽快上机，减少细胞的黏连。

一定要设置合适的对照。一些细胞类型如巨核细胞、骨髓细胞和血小板细胞表面存在大量磷脂酰丝氨酸，因此要设置合适的对照组，保证实验结果的准确性。

PI核酸类的染料容易黏连，上样前可以过滤去除大的细胞团，另外需要尽快上机减少黏连的信号，收集数据以后，A和H（或者A和W）去除黏连信号。

除了用Annexin V FITC和PI检测细胞的凋亡，死活染料也可以用7-AAD，JC探针、MitoSpyTM探针、伯胺类染料等。检测细胞凋亡的方案那么多，哪一种是最适合您的样本的呢？让我们一起来用层浪的流式仪解锁更多细胞凋亡检测方案吧。